近年來，能夠產(chǎn)生胞外多糖(EPS)的發(fā)酵劑的重要性顯著增加，例如幾種乳酸菌(LAB)。在發(fā)酵乳制品中，EPS影響產(chǎn)品粘度和口感。EPS具有較高的水結(jié)合能力，對(duì)整個(gè)體系的粘度影響較大。以分離形式用于食品和制藥工業(yè)的EPS的例子有右旋糖酐或黃原膠。此外，重要的是要知道，由LAB產(chǎn)生的EPS要么附著在細(xì)胞壁上(莢膜EPS)，要么釋放到周圍的培養(yǎng)基中(游離EPS)。

發(fā)酵劑的工業(yè)生產(chǎn)包括兩個(gè)主要過程步驟，在特定條件下發(fā)酵以及隨后從發(fā)酵液中分離細(xì)菌，這通常是用盤堆離心機(jī)完成的。在這里，EPS對(duì)發(fā)酵液粘度的影響使分離步驟變得困難。另一個(gè)復(fù)雜的因素是不同的發(fā)酵劑通常在同一條生產(chǎn)線上生產(chǎn)，這就是為什么分離條件應(yīng)該根據(jù)各自的菌株進(jìn)行調(diào)整。EPS的特性和類型(游離型、莢膜型或兩者都有)對(duì)發(fā)酵液的粘度有特定的影響，因此對(duì)細(xì)菌的沉積特性也有特定的影響。經(jīng)驗(yàn)觀察表明，在細(xì)胞分離前應(yīng)用高速剪切均質(zhì)可改善培養(yǎng)物的沉淀特性，但這種改善也取決于所產(chǎn)生的EPS類型。

本研究的目的是系統(tǒng)地研究高速剪切均質(zhì)步驟對(duì)產(chǎn)EPS的乳酸菌菌株分離性能的影響。

1. 材料和方法  

1.1 材料  

研究了六種不同的嗜熱鏈球菌（ST）菌株，這些菌株在平均細(xì)胞鏈長(zhǎng)度和產(chǎn)生莢膜EPS的能力上存在差異(表1)。

表1 未剪切嗜熱鏈球菌莢膜EPS產(chǎn)量和平均細(xì)胞鏈長(zhǎng)度

1.3 顆粒沉降速度分析  

用光學(xué)分析離心機(jī)(LUMiSizer, LUM GmbH, Berlin, Germany)測(cè)量未剪切和剪切樣品的沉降速度分布。將稀釋樣品(與生理氯化鈉溶液的比例為1:2)填充到每個(gè)樣品管中，使用3600 rpm進(jìn)行測(cè)試。采用恒定位置法，在靠近樣品管底部的三個(gè)徑向位置(123、125和127毫米) 用SEPView程序計(jì)算沉降速度分布。

1.4 沉積物壓縮行為分析  

使用LUMiSizer測(cè)量樣品的沉積物壓縮。樣品管中加入未稀釋的樣品，LUMiSizer的速度以500 rpm為步階在1500 rpm和4000 rpm之間變化。

2. 結(jié)果與分析  

2.1 顆粒沉降速度

圖1 在19000rpm下剪切10 s（長(zhǎng)虛線）、30 s（短虛線）和120 s（虛線）后，未剪切（實(shí)線）細(xì)菌菌株ST-D（游離EPS，灰色）和ST-C（莢膜EPS，黑色）的沉降速度分布

由圖1可知，未剪切的ST-D沉積速度分布非常廣泛，從100 μm/s到近2000 μm/s。這可以歸因于細(xì)菌形成長(zhǎng)細(xì)胞鏈的能力(每鏈含2-19個(gè)球菌，見表1)，導(dǎo)致顆粒物體的體積和表觀顆粒尺寸增加。由于分布較廣，速度的頻率分布 (即在相同速度下沉積的顆粒數(shù)量的指標(biāo))很低。以19,000 rpm的UT速度剪切10秒，快速沉降顆粒的數(shù)量減少了，較慢沉降顆粒的數(shù)量增加了。結(jié)果，最大速度的頻率從0.6(未剪切)增加到1.0(剪切)。這反映了剪切作用對(duì)細(xì)胞鏈的部分破壞(圖2)。隨著剪切時(shí)間的增加，細(xì)胞鏈被破壞的程度更大，導(dǎo)致沉積速度進(jìn)一步降低。在19,000 rpm剪切120 s后，平均鏈長(zhǎng)由13個(gè)單元減少到6個(gè)單元，在沉降速度為300 μm/s時(shí)，最大速度分布密度為2.4。

與ST-D相比，剪切后的ST-C沉積速度更高。在120 μm/s左右的沉降速度條件下，未剪切試樣的沉降速度主峰值為80 ~ 250 μm/s，最大沉降速度頻率為1.4。快速沉降顆粒(可能是細(xì)胞鏈)和緩慢沉降顆粒(可能是細(xì)胞碎片或細(xì)顆粒)也可見。使用UT在19,000 rpm下剪切10s后，沉降速度分布明顯提高。這種變化可以通過檢查ST-C產(chǎn)生的莢膜EPS層來解釋(見圖2未剪切和剪切培養(yǎng)的顯微鏡圖像)。將樣品與印度墨水混合，由于墨水顆粒無法滲透到莢膜多糖中，可見在細(xì)菌細(xì)胞周圍呈明亮層。顯微鏡圖像表明，膠囊是在剪切過程中被去除的。由于EPS具有較高的水結(jié)合能力，我們假設(shè)細(xì)胞周圍的莢膜EPS層起到了一種摩擦墊的作用，降低了細(xì)胞的沉積速度。所以，剪切去掉莢膜EPS層后，沉降速度升高是符合預(yù)期的結(jié)果。隨著剪切時(shí)間的增加，沉降速度沒有進(jìn)一步提高，但細(xì)胞鏈斷裂明顯。剪切120 s后，在沉降速度約為140 μm/s時(shí)，最大沉降速度分布密度增大到2.3。這表明在細(xì)胞鏈被破壞之前，莢膜EPS已經(jīng)被剪切掉。對(duì)于產(chǎn)生游離EPS的菌株（ST-E），觀察到了類似的結(jié)果，即剪切后沉降速度增加，可能是由于發(fā)酵液粘度發(fā)生了改變。在19,000 rpm的轉(zhuǎn)速下剪切120 s后，無細(xì)胞肉湯的表觀粘度下降了40%。因此，平均沉降速度由182 μm/s增加到206 μm/s，可以用Stokes定律解釋。

圖2  ST-D（游離EPS菌株）的顯微照片未剪切（左上），在24000rpm下剪切120秒（右上）。ST-C（莢膜EPS菌株）的顯微照片（印度墨水進(jìn)行染色）未經(jīng)剪切（左下），并在24000rpm下剪切120秒（右下）。  

2.2 能量輸入對(duì)顆粒沉降速度的影響  

圖3 剪切能輸入對(duì)細(xì)菌細(xì)胞沉降速度的影響。應(yīng)變標(biāo)識(shí):ST-C，黑色方塊;ST-D，黑色圓圈;ST-E，灰色圓圈;ST-G，黑色三角形;ST-H，灰色三角形;ST-I，灰色方塊。

圖3說明了六種ST菌株的沉降速度存在較大差異，剪切處理在不同程度上影響了沉降速度。沉淀最快的菌株是ST-D，它產(chǎn)生游離EPS并形成最長(zhǎng)的細(xì)胞鏈（見表1）。另一種產(chǎn)生游離EPS的菌株ST-E的沉降速度明顯低于ST-D，而ST-D的沉降速度又高于四種產(chǎn)生莢膜EPS的菌株。這是將莢膜EPS層解釋為減速摩擦墊的另一個(gè)原因。對(duì)于所有菌株，沉降速度與能量輸入呈對(duì)數(shù)依賴性或幾乎保持不變。隨著能量輸入的增加，產(chǎn)生莢膜EPS的菌株表現(xiàn)為沉積速度增加的趨勢(shì)，該現(xiàn)象可以通過剪切破壞了菌株周圍用于減速的莢膜EPS層來解釋。

3. 結(jié)論  

本研究表明，剪切可以影響發(fā)酵培養(yǎng)基中細(xì)菌細(xì)胞的沉降速度。結(jié)果表明:(a)剪切莢膜EPS對(duì)沉積速度的影響最大;(b)對(duì)于只產(chǎn)生游離EPS的菌株，剪切降低了發(fā)酵液表觀粘度，從而提高了沉淀速度;(c)長(zhǎng)細(xì)胞鏈的破壞導(dǎo)致顆粒尺寸變小，從而導(dǎo)致沉降速度降低。平均沉降速度的比較揭示了這三種影響的組合。由于粘度的變化導(dǎo)致較高的沉降速度，使沉積物形成速度加快，但對(duì)沉積物壓縮沒有影響。細(xì)胞鏈的破壞降低了沉積速度，但由于顆粒尺寸的減小，導(dǎo)致沉積物更加致密。由于剪切作用發(fā)酵劑表面的莢膜EPS減少，從而降低了顆粒之間的相互依賴性，因此，導(dǎo)致沉積物的強(qiáng)烈壓實(shí)，這可能有助于發(fā)酵劑生產(chǎn)過程中細(xì)胞的分離。